ELISA樣本制備指南及注意事項_4tvgB
ELISA樣本制備指南及注意事項
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定義及介紹
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附測定）是最基礎(chǔ)的免疫學(xué)實驗之一，其理論基礎(chǔ)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。ELISA因其特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好而被廣泛使用。ELISA試劑盒檢測樣品包括血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、灌洗液或尿液等生物樣本，實驗操作步驟并不繁瑣，但實驗完成后需要把樣本檢測結(jié)果OD值轉(zhuǎn)化為濃度值，從而供下一步分析所用，因此樣品的預(yù)處理對于后續(xù)數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析非常重要。
樣本制備指南
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血清
全血樣品于室溫放置2小時或2-8℃過夜后于2-8℃，1000×g離心20min，取上清即可檢測。收集血液的試管應(yīng)為一次性的無內(nèi)毒素試管。避免使用溶血，高血脂樣品
2.血漿
抗凝劑推薦使用EDTA-Na
2，樣品采集后30min內(nèi)于2-8℃，1000×g離心15min，取上清即可檢測。
3組織勻漿/組織全蛋白
用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行反復(fù)凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10min，取上清檢測。
其余方法：在分析天平（AL204型）上，稱量50-100mg組織樣本。在樣本中加入5倍質(zhì)量體積的含1%PMSF的1×PBS緩沖液；并用小剪刀等工具將組織樣本剪碎（盡可能小塊）。注：1×PBS緩沖液使用前，需加入PMSF，現(xiàn)用現(xiàn)加，PMSF終濃度為1mM。打開超聲破碎儀，將超聲破碎儀的功率調(diào)至25%，超聲時間2s，間隔時間5s，總時間2min。放入樣本，冰上超聲3min。視樣本勻漿情況調(diào)整總時長。超聲完成后，將樣本放于4℃或冰上裂解30min。打開離心機，將轉(zhuǎn)速調(diào)至12000×g；將樣本放入離心機，離心10min，取上清，按需要分裝，于-20℃貯存。注：留取20μL樣本，用于后續(xù)BCA法測定樣本蛋白含量。
組織勻漿液或組織全蛋白中的蛋白濃度對于檢測實驗的影響至關(guān)重要，建議樣本蛋白濃度至少1mg/mL以上，較低濃度蛋白的組織勻漿液有可能導(dǎo)致ELISA檢測失敗。
4.細胞提取液
貼壁細胞
用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5min后收集細胞；
懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每10
6個細胞中加入150-200μLPBS重懸(推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復(fù)凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10min，取上清檢測。注：留取20μL樣本，用于后續(xù)BCA測定。
其余方法：
對于
貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。以2百萬細胞為例，在樣本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS緩沖液，震蕩混勻細胞，4℃或冰上裂解30min。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。必要時可以進行超聲處理，超聲步驟與組織樣本相同。
對于
懸浮細胞：離心收集細胞，以2×10
6細胞為例，在樣本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS緩沖液，震蕩混勻細胞，4℃或冰上裂解30min。用手指輕彈懸浮細胞以充分裂解。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成（5-10）×10
5細胞/管，然后再裂解。必要時可以進行超聲處理，超聲步驟與組織樣本相同。注：1×PBS緩沖液使用前，需加入PMSF，現(xiàn)用現(xiàn)加，PMSF終濃度為1mM。打開離心機，將轉(zhuǎn)速調(diào)至12000×g；將樣本放入離心機，離心10min，取上清，按需要分裝，于-20℃貯存。注：留取20μL樣本，用于后續(xù)BCA法測定樣本蛋白含量。
5.細胞培養(yǎng)上清或其他生物體液
收集液體后于2-8℃，1000×g離心20min，除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。注：因細胞培養(yǎng)基中的胎牛血清影響或其他生物體液中雜蛋白的影響，不建議進行BCA法測定樣本蛋白含量。
實驗細節(jié)與注意事項
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收集血液應(yīng)避免產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。紅細胞破碎，釋放大量的過氧化物酶，會影響ELISA檢測中的辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶促反應(yīng)，造成檢測結(jié)果的不確定性。
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樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃(3個月內(nèi)檢測)，避免反復(fù)凍融。在檢測前，冷凍過的樣本應(yīng)緩慢地融化并離心除去凍融過程產(chǎn)生的沉淀物。室溫混勻后使用。
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試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低，請對樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。
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檢測樣本的稀釋推薦多步稀釋法，常規(guī)稀釋檢測為血清/血漿檢測稀釋度為2倍、20倍、200倍；細胞上清稀釋度為5倍、50倍、500倍；建議實驗前通過相關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度。
對于稀釋倍數(shù)比較大的檢測樣本，參考稀釋方案如下：
稀釋100倍：一步稀釋。取5μL樣本到495μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液內(nèi)，做100倍稀釋；
稀釋1000倍：兩步稀釋。取5μL樣本到95μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液內(nèi)，做20倍稀釋，再取5μL 20倍稀釋樣本到245μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，總共稀釋1000倍；
稀釋100000倍：三步稀釋。取5μL樣本到195μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液內(nèi)，做40倍稀釋，再取5μL 40倍稀釋樣本到245μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，最后取5μL 2000倍稀釋樣本到245μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，總共稀釋100000倍；
每步稀釋時取液量不少于3μL，稀釋倍數(shù)不超過100倍。每步稀釋都需混合均勻，避免起泡。
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若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。
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若使用化學(xué)裂解液制備組織勻漿或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。
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某些重組蛋白可能與試劑盒中捕獲或檢測抗體不匹配而出現(xiàn)不能檢測的情況。
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對于組織勻漿、組織全蛋白、細胞提取液等蛋白提取樣本，經(jīng)BCA法測定樣本蛋白含量后，建議進行蛋白濃度的統(tǒng)一化，避免因組織重量、細胞數(shù)、產(chǎn)物體積等因素造成的人為誤差；例如，統(tǒng)一全部檢測樣本濃度為1-2mg/mL，進行后續(xù)的稀釋和檢測。
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廣東目前有非常多厲害的試管嬰兒醫(yī)院，這些醫(yī)院主要都集中在當(dāng)?shù)亟?jīng)濟較為發(fā)達的城市，而排名前十的醫(yī)院也是如此，下面就為大家具體介紹：
廣東省試管嬰兒排名前十的醫(yī)院排名醫(yī)院名稱成功率開展技術(shù)1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院55%-65%夫精/供精人授、一代/二代/三代試管2廣東省婦幼保健院55%-65%夫精/供精人授、一代/二代/三代試管3北京大學(xué)深圳醫(yī)院55%-60%夫精人授、一代/二代/三代試管4深圳市婦幼保健院55%-60%夫精人授、一代/二代/三代試管5中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院50%-60%夫精人授、一代/二代/三代試管6中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院50%-60%夫精人授、一代/二代/三代試管7珠海市婦幼保健院50%-60%夫精人授、一代/二代/三代試管8中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院50%-55%夫精人授、一代/二代/三代試管9中山市博愛醫(yī)院50%-55%夫精人授、一代/二代/三代試管10汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院50%-52%夫精/供精人授、一代/二代試管